Typisierung

Typisierung mit Hybridisierungssonden - Prinzip

Ihr einzigartiges Potential entfalten die Hybridisierungssonden bei der Typisierung von Sequenzvariationen. Das können einzelne Basenaustausche sein, oder Deletionen und Insertionen, aber auch sonstige Varianten, zum Beispiel verwandte Sequenzen oder Splice-Varianten.

Das Prinzip der Hybridisierungssonden ist denkbar einfach – die 'Sensor'-Sonde überdeckt die variable Sequenz, und die benachbarte 'Anker'-Sonde ist deutlich bindungsstärker, so daß in der Analyse der Schmelzpunkte nur die 'Sensor'-Sonde erfasst wird. Dafür werden die hybridisierten Produkte langsam, unter stetiger Messung der Fluoreszenz erhitzt. Jede Änderung der Sequenz unter der Sensorsonde führt zu einer Erniedrigung des Schmelzpunktes. Eine einheitliche Probe ergibt einen definierten Schmelzpunkt, eine heterozygote Probe zwei Schmelzpunkte, und eine homozygot veränderte, mutierte Probe einen einheitlichen Schmelzpunkt bei einer niedrigeren Temperatur. Ein Basenaustausch alleine verursacht dabei eine Änderung von 2-10°C, abhängig von der Art des Austausches, und der Nachbarschaft dieser Base.

Varianten können allerdings nur bestimmt werden, wenn sie vergleichbaren Mengen vorliegen. Das ist bei genetischen (allelischen) Untersuchungen der Fall, aber bei der Bestimmung von Kontaminationen, seltenen Varianten wie sie zum Bespiel bei Krebserkrankungen (MRD) auftreten, oder gemischten Populationen, nur begrenzt möglich. In diesen Fällen würde man typ- oder allelspezifische Primer verwenden, um die unterrepräsentierten Varianten spezifisch zu amplifizieren und quantifizieren. Die Fläche der Schmelzkurven kann im Übrigen nur limitiert für eine Mengenbestimmung verwendet werden, denn oft haben die Sonden verschiedene Affinitäten zu den vorliegenden Zielsequenzen. In etablierten Systemen reicht die Fläche allerdings dazu aus, um Verhältnisse von 1:1 und 2:3 zu unterscheiden, wie sie beispielsweise für den Nachweis einer Trisomie benötigt würden.

Typisierung mit Hybridisierungssonden - Platzierung

Die 'Sensor'-Sonde überdeckt die zu detektierende Stelle ungefähr mittig, jedenfalls nicht näher als vier bis fünf Basen vom Rand entfernt; dabei kann 'Mitte' auch über die Bindungsstärke definiert sein, ein GC-reiches Ende könnte also viel kürzer sein.

Es gibt prinzipiell vier Möglichkeiten zur Platzierung, mit einer Ankersonde rechts oder links, oder entsprechend auf dem Gegenstrang rechts oder links. Daher lassen sich 'ungeeignete' Sequenzabschnitte, insbesondere benachbarte Palindrome und Stemloop-bildende Sequenzmotive schlechter umgehen. Ein zu detektierender Basenaustausch könnte zum Beispiel inmitten von stark-bindenden Abschnitten gelegen sein. Mit Computerprogrammen, die die lokale Bindungsstabilität berechnen, lassen sich die Sonden durchaus optimieren; sehr stark bindende Motive können durch die Verwendung von schwächer bindenden Basenanaloga oder sogar falschen Basen in ihrem Einfluß gezielt geschwächt werden. Man verwendet dafür 5-halognierte Pyrimidinbasen, und anstatt von Guanosin vorzugsweise das bindungsschwächere und unspezifischere Inosin.

Generell ist zu beachten, daß die G-T Fehlpaarung relativ gut toleriert wird, da diese beiden Basen eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden. Die Temperaturminderung beträgt daher nur ein bis vier Grad. Statt einer 'Sensor'-Sonde mit 'G' oder 'T' sollte man daher entweder die mutierte Sonde verwenden, oder die Sonden auf den Gegenstrang legen, so daß eine A-C Fehlpaarung resultiert.

Typisierung mit Hybridisierungssonden - Spezifität

Deletionen und Insertionen geben geringere Temperaturdifferenzen als Substitutionsmutationen. Insbesondere für monotone Sequenzabfolgen, zum Beispiel dem 4G/5G Polymorphismus im PAI-1 Gen (Nauck et al., 1999) oder im Connexin-26 35G del mit fünf oder sechs Guanosinbasen ist die Detektion sehr schwierig.

Meistens werden andere Mutationen, die von der Sonden mit überdeckt werden, zu einem anderen Temperaturprofil führen. Ein Beispiel wäre die HFE Variante Ser65Asp, die zunächst durch eine falsche Temperatur aufgefallen ist (Bollhalder et. al. Clin.Chem (2000)). Prinzipiell können andere, möglicherweise noch nie beschriebene Mutationen einen gleich großen Effekt hervorrufen, also zu einer Fehldiagnose führen. Wenn man nun zur Sicherheit die mutationsspezifische Sonde verwendet, könnte eine Doppelmutation für einen Wildtyp gehalten, also nicht erkannt werden. Für eine medizinische Diagnostik sollte man daher unter Umständen erwägen, beide Sonden simultan zu verwenden. Das ist sehr elegant möglich, indem man die beiden verschiedenen Farbstoffe verwendet, die in den Kanälen F2 und F3 gleichzeitig gemessen werden können.

Beispiele für kritische Targets:

EIm Exon 10 des humanen CTFR Genes gibt es eine Deletion (Phe508 del), eine Variante 508 Serin, sowie benachbart andere Deletionen und auch einen nicht pathogenen Polymorphismus. Eine Wildtyp-Sonde kann diese Varianten nicht unbedingt unterscheiden.

Für das humane k-ras Gen gibt es in den Codons 12 und 13 verschiedene Varianten, die alle mit einer wildtyp-spezifischen Sonde erfaßt werden können. Eine mutationsspezifische Sonde wird den Wildtyp nicht sicher von anderen Varianten unterscheiden können.

Beide, sowohl die 3'-Fluorescein als auch die 5'-LightCycler® Red-markierte Sonde kann als Sensor-Sonde verwendet werden. Erstere hat den Vorteil, daß die Fl Sonde billiger und schneller herzustellen ist, so daß man mit dieser einen Test besser optimieren kann, oder diese vorzugsweise für patientenspezifische Sonden verwenden wird, so bei der Analyse von Rearrangements bei der Leukämiediagnostik (Beispiel: Eckert et al. Leukemia (2000)). Trägt die Sensor-Sonde den LightCycler® Farbstoff, hat das den Vorteil, daß man die wildtyp- und mutationsspezifische Sonde mit den beiden unterschiedlichen Farbstoffen simultan einsetzen kann.

Abschließend ist zu Bedenken zu geben, daß einzelne Basenaustausche die Amplifikation eines Alleles stark beeinflussen können, oder daß die verschiedenen Varianten unterschiedlich gut von den Sonden gebunden werden, zum Beispiel aufgrund der Ausbildung von stabilen Sekundärstrukturen, so daß eine Variante möglicherweise nicht oder viel schlechter zu detektieren ist. Weiterhin können Mutationen oder Deletionen in den Primerbindungsstellen, insbesondere wenn diese in intronischen Sequenzen gelegen sind, möglicherweise weniger gut konserviert, die Amplifikation des einen Alleles unterbinden, so daß man fälschlich von einer homozygoten Situation ausgeht (Beispiel: Intron 4-Mutation bei HFE, Jeffrey et al., Nature Genetics 1999). Man sollte daher unserer Meinung nach neue Assays immer mit sequenzierten oder typisierten Proben validieren, und nicht anhand von publizierten Mutationen Assays entwerfen, um mit diesen die publizierten Mutationen aufzuspüren.

Hinweise für Sonden für die Typisierung

Die Schmelzkurve wird nach der PCR durchgeführt – daher ist die Kompetition zwischen Primern und Sonden weniger relevant. Für die Positionierung bedeutet das, daß Sonden und Primer im Extremfall sogar überlappen können, für die Schmelztemperaturen, daß sie nicht höher als die der Primer sein müssen.

Schmelzpunkte der Sonden sind zumeist höher als die der Primer.

Wenn der Schmelzpunkt der Sonden geringer als der der Primer ist, wird man mit diesen Sonden während der PCR kein oder kaum ein Signal sehen.

Die Position ist nicht sehr relevant.

Sonden sind meist entfernt von den Primern, sie dürfen aber auch dichter benachbart sein.

Die Anker-Sonde muß deutlich höherschmelzend (4-8°C) als die Sensor-Sonde sein.

Die Schmelzkurve soll alleine die Bindung der Sensor-Sonde beschreiben.

Die untersuchte Sequenzvariation (Mutation) liegt ungefähr mittig unter der Sensor-Sonde, jedenfalls nicht näher als 4 Basen vom Rand.

Eine Fehlpaarung verringert die Kooperativität der Bindung zweier Bereiche. Randbereiche können ohnehin etwas 'flattern' und eine Fehlpaarung in diesem Bereich verursacht nur eine geringe Minderung der Schmelztemperatur.

G-T Fehlpaarungen sollten vermieden werden. Eine mutationsspezifische Sonde oder eine Sonde auf dem Gegenstrang hat stattdessen eine A-C Fehlpaarung.

G-T Fehlpaarungen werden recht gut toleriert und führen zu einer kleineren Reduktion der Schmelztemperatur von 2-4°C gegenüber 5-10°C für andere Fehlpaarungen.

Sehr fest bindende Sequenzmotive sollten nicht in die Sonden genommen werden, oder, wenn unvermeidlich, durch Basenanaloga oder sogar Fehlbasen abgeschwächt werden.

Sehr fest bindende Sequenzmotive können den Effekt einer Fehlpaarung überdecken.

Sonden sollten keine Stem-Loop Sequenz enthalten.

Wenn die Sonden Stem-Loop Sequenzen enthalten, existiert neben der freien und der gebundenen Sonde auch eine gefaltete Struktur, die unter Umständen stabiler als die Bindung an die Variante mit der Fehlpaarung ist. Als Resultat können die beiden Varianten unterschiedlich stark gebunden werden, so daß die schwächer bindende Variante möglicherweise übersehen wird.

Die Primer sollten nicht auf variablen Bereichen sitzen.

Mutationen unter den Primern können deren Effizienz beeinträchtigen, so daß eventuell nur ein Allel amplifiziert wird.

Unbekannte Mutationen.

Andere Sequenzvariationen könnten denselben Effekt hervorrufen, so daß man für wichtige Fragestellungen Wildtyp- und mutierte Sonde parallel einsetzen sollte.

Test eines neuen Assays

Es empfiehlt sich beim Entwurf neuer Assays entweder von etablierten PCR-Systemen auszugehen oder bei ganz neuen Systemen den PCR-Teil getrennt anzusetzen, und die Ergebnisse 'klassisch' über ein Agarosegel zu überprüfen. Wenn man dagegen ein neues System sofort in den LightCycler® gibt, wird einem ein 'Nichtergebnis' keine Möglichkeit zur Fehlerfindung geben, denn es könnte am Target, den Primern, den PCR-Bedingungen, an den Sonden oder an dem Gerät liegen. Das unspezifische SYBR-Green Format hilft auch nur eingeschränkt, daß Primerdimere und ein Produkt ohne eine Referenz nicht auseinanderzuhalten sind. Der LightCycler® ist im Übrigen, genauso wie die anderen am Markt befindlichen 'Real-Time' PCR Geräte nicht empfindlicher als eine konventionelle PCR; sieht man im Gel kein Produkt, wird man auch mit dem LightCycler® kein Fluoreszenzsignal bekommen.

  • Verwende etablierte Primer. Wenn die Primer neu/unbekannt sind, sollte das resultierende Produkt auf einem Agarose Gel überprüft werden.
  • Für neue Assays sollte man mehrere Primer je Richtung verwenden und vergleichen.
  • Für neue Sonden Konzeption und Farbstoff/ Kanal überprüfen.
  • Für neue Assays sollte man 'mittlere' DNA-Mengen als Target verwenden, also weder 'Einzelzell' Bedingungen noch zu viel Material. Das Maximum an Target-Menge für ein 20 µl Reaktion liegt bei 1 µg DNA (106 humane Genome, 6 pg/diploides Genom).
  • yophilisierte Primer und Sonden nicht einfrieren, dunkel bei Raumtemperatur lagern.
  • Primer und Sonden in dest. Wasser oder besser in Puffer (TE Puffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) lösen, für längere Zeit bei –20°C gefroren aufbewahren. Häufiges Auftauen vermeiden, Aliquots verwenden.