Einleitung

Einleitung - Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET)

Hybridisierungssonden bestehen aus einem Paar Oligonukleotiden, die benachbart hybridisieren können. Sie tragen an den aufeinander zu gerichteten Ende zwei Fluorophore, die über Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) miteinander interagieren können. Dabei überträgt der kurzwelligere Farbstoff Fluorescein, der mittels blauen Lichtes angeregt wird, seine Energie strahlungslos an den langwelligeren Farbstoff LightCycler® Red. Dieser gibt ein rotes Licht ab, das detektiert wird. Das Signal kommt also nur zustande, wenn beide Sonden in räumlicher Nähe binden. Bei einem Übeschuß an Sonden ist die Signalfluoreszenz proportional zur Menge der vorliegenden Zielsequenz.

Grundlagen zur Hybridisierung

Zwei Nukleinsäurestränge binden aneinander, wenn ihre Sequenzen komplementär sind. Die Effizienz der Hybridisierung hängt von der tatsächlichen Sequenz ab. Das Verständnis der molekularen Grundlagen erleichtert die Auswahl geeigneter Hybridisierungssonden.

Der Prozess der Hybridisierung ist von der tatsächlichen Zielsequenz und Sonde abhängig. Zum Verständnis betrachtet man die Situation in Lösung: Zwei komplementäre Sequenzen ziehen sich nicht über die Entfernung an, sondern die einzelnen Moleküle treffen sich zufällig durch Kollision. Liegen komplementäre Sequenzabschnitte vor, können beide aneinander binden. Das gilt natürlich in gleichem Maße auch für nur 'ähnliche' Zielsequenzen. Bei einer Übereinstimmung der benachbarten Basen werden sich ausgehend von dem initialen Kristallisationspunkt die Basen nach dem Reißverschlußprinzip binden.

Die Bindung ist reversibel. Die Stärke der Bindung berechnet sich in thermodynamischen Größen. Sie kann auch als Wahrscheinlichkeit der Bindung betrachtet werden. Bei einem kinetischen Ansatz wird man On-Raten und Off-Raten vergleichen. In der Praxis wird der Schmelzpunkt Tm als messbare Größe verwendet. Der Tm beschreibt die Temperatur, bei der gebundene und freie Sequenz miteinander im Gleichgewicht stehen. Der Tm kann in einer Schmelzkurve experimentell bestimmt werden.

Um eine hohe Bindungsrate zu erreichen, wird man einen Überschuß an Hybridisierungssonden verwenden.

Die Auswahl von Hybridisierungssonden

Im folgenden Text werden einige Auswahlregeln erläutert. Diese fallen für die beiden hauptsächlichen Applikationen - Quantifizierung und Typisierung - unterschiedlich aus.

Für die Quantifizierung ist es wichtig, ein starkes Signal zu generieren. Die Sonden können dabei an einer beliebigen Stelle der Zielsequenz positioniert sein.

Bei einer Typisierung müssen die Sonden an der bezeichneten Stelle liegen, und es ist nicht unbedingt möglich, weniger geeignete, 'schwierige' Sequenzmotive zu umgehen.

Für einige Fragestellungen ist eine Analyse mit Hybridisierungssonden nicht möglich:

  • Bestimmung der Anzahl (längerer) repetitiver Sequenzelemente
  • die Analyse von Variationen innerhalb von repetitiven Sequenzen
  • eine differenzielle Quantifizierung in einer Duplex-PCR, wenn extrem unterschiedliche Mengen an Zielsequenz vorliegen
  • eine differenzielle Quantifizierung unter Verwendung identischer Primer und typspezifischer Sonden