Quantifizierung

Quantifizierung – die Sonden konkurrieren mit dem verlängerten Primer und dem Re-Annealing der DNA Einzelstränge

Damit die Hybridisierungssonden ein Signal geben, müssen sie an eine einzelsträngige Zielsequenz binden, die in der PCR nur während der thermischen Denaturierung und kurz darauf vorhanden ist. Während der Abkühlphase konkurrieren die Primer mit den Sonden – zwar nicht um dieselbe Stelle, aber, wenn ein Primer einmal gebunden hat, wird er unverzüglich verlängert, so daß die Zielsequenz unweigerlich überdeckt wird. Dieser Prozeß ist zudem irreversibel, denn ein verlängerter Primer ist bindungsstabiler und wird sich in diesem Zyklus nicht mehr lösen, wohingegen die Sonde nur reversibel binden. Da die Sonden ebenfalls an den DNA-Einzelstrang binden müssen, besteht die Konkurrenz sogar zwischen einem Primer und zwei Sonden. Daher sollten die Sonden signifikant besser an die Zielsequenz binden, also eine deutlich höhere Schmelztemperatur als die Primer aufweisen.

Grenzen für die Quantifizierung

  • Das Detektionslimit für eine DNA-PCR liegt bei 2-10 Kopien (Genome). Das Limit ist anhängig von der Auswahl der Primer und dem Target, und nur minimal von der Auswahl der Sonden
  • Das Detektionslimit für eine RT-PCR liegt bei 10-50 Kopien (Genome), wenn die RT-Reaktion getrennt durchgeführt wird, und 10-20-fach höher für eine Einschritt RT-PCR
  • Das Detektionslimit ist sehr oft durch den Verlust von Proben während der Extraktion oder durch die Verdünnung in der Aufarbeitung verschlechtert (viele Extraktionskits liefern eine Menge von 100-200 µl Lösung)
  • Mit der PCR kann man ein Verdopplung einer Menge nur noch eingeschränkt nachweisen (entspricht der Verschiebung um einen Zyklus) und sie ist daher nicht geeignet, geringe Änderungen in der Transkription oder Ereignisse wie eine Trisomie nachzuweisen
  • Für Proben mit einer sehr geringen Menge kann man mit Träger-Nukleinsäuren arbeiten (bis 1 µg / 20 µl, z.B. Heringssperma DNA, Plazenta DNA, Hefe RNA)
  • Für klonierte Standards (Plasmid) sollte man mit Träger-Nukleinsäuren arbeiten
  • In Duplex-PCR Systemen kann die PCR von dem geringer konzentrierten Zielgen von dem stärkeren inhibiert werden. Daher sollte man keine stark exprimierten Housekeeping Gene verwenden
  • Zwei Varianten können nicht mit derselben Sonde differenziell quantifiziert werden

Die Schmelztemperatur entspricht der Bindungsstärke

Die Konkurrenzsituation zwischen den Sonden und den Primern, bzw. dem Primer mit derselben Laufrichtung wie die Sonden bedeutet, daß ihre Schmelztemperatur höher sein sollte. Wir empfehlen einen Abstand von 5-10°C, allerdings innerhalb der folgenden Grenzen:

(1) Die Schmelztemperatur darf nicht zu hoch sein, damit die Sonden noch von dem wachsenden Strang verdrängt werden können. Andernfalls wird die Amplifikation behindert und die PCR ist inhibiert. Als groben Richtwert nehmen wir 5°C oberhalb der Extensionstemperatur, beziehungsweise 5-10°C. Dasselbe gilt im Übrigen auch für alle anderen Sonden, die während einer PCR zugegen sind, beispielsweise TaqMan Sonden oder Molecular Beacons.

(2) Die Schmelztemperatur muß oberhalb der Annealingtemperatur liegen, damit die Sonden tatsächlich binden können. Für sehr kurze und bindungsschwache Primer kann die Schmelztemperatur der Sonden daher durchaus um mehr als 10°C erhöht sein.

Alternativ lassen sich Primer anpassen, um die oben beschriebenen Verhältnisse zu schaffen. Wenn man einen Primer an seinem 5'-Ende verändert, wird man seine Spezifität im Allgemeinen nicht ändern und wird sich eine aufwendige neue Evaluierung eines bestehenden Systems wahrscheinlich ersparen können. Wenn am 5'-Ende keine weiteren Basen bekannt sind, um einen Primer zu verlängern, kann man beliebige Basen anhängen, so daß die Primer nach einem einmalig erfolgreichen Zyklus die entsprechend verlängerte Zielsequenz vorfinden werden.

Die Position von Hybridisierungssonden

Prinzipiell können die Hybridisierungssonden irgendwo auf der Zielsequenz binden. Aufgrund der Konkurrenzsituation oder einer Kompetition mit den Primern und dem wachsenden Strang wird man die Sonden vorzugsweise entfernt von den Primern setzen, das bedeutet 'weit rechts' auf dem oberen Strang oder 'weit links' bei der Verwendung einer Sequenz aus dem unteren Strang. Die Sonden binden naturgemäß auch an anderen, nah verwandten Stellen. Das ist insbesondere bei repetitiven Sequenzen leicht erkennbar, denn die Sonden können um jeweils das repetitive Element verschoben binden. Die Konsequenz der Bindung einer Sonde an anderen Stellen ist kein falsches Signal, sondern die Reduzierung ihrer 'freien' Konzentration und schwächt somit das Fluoreszenzsignal. Dieser Effekt ist erst in den späten Zyklen von Bedeutung, wenn genügend Zielsequenz entsprechend amplifiziert ist. Im Gegensatz zum Design von Primern sind daher komplementäre Stellen außerhalb des amplifizierten Bereiches ohne Relevanz.

Hinweise für Sonden für die Quantifizierung

Das Fluoreszenzsignal ist proportional zur Targetmenge. Damit ein starkes Fluoreszenzsignal entsteht, müssen die Sonden gut binden. Da die Sonden mit dem Primer auf demselben Strang konkurrieren, müssen sie fester als dieser Primer binden. In späteren Zyklen wird auch die Re-Hybridisierung der Einzelstränge konkurrieren und das Fluoreszenzsignal vermindern (Hook-Effekt).

Die Sonden sollten tendenziell weit entfernt vom Primer auf demselben Strang liegen.

Der verlängerte Primer in derselben Laufrichtung wird die Zielsequenz der Sonden irreversibel überdecken. Ein größerer Abstand verlängert die Zeit in der das Target frei verfügbar ist.

Die Schmelztemperatur der Sonden sollte 5-10°C höher als die der Primer sein, insbesondere als der Primer derselben Laufrichtung.

Zwei Sonden konkurrieren mit der Bindung von nur einem Primer. Sie müssen daher deutlich fester binden.

The Tm of the probes should be higher than the annealing temperature.

The signal has to be obtained during the annealing step.

The Tm of the probes should not be much higher than the extension temperature.

This may cause the probes to block primer extension.

Um Sonden für ein gegebenes PCR-Fragment auszusuchen, beginnt man die Suche am besten 'weit hinten' auf dem oberen Strang und 'ganz vorne' auf dem unteren Strang. Bei Inkompatibilitäten mit den Primern kann man auch diese um einige Basen verschieben. Bei neuen Systemen kann man mit der Auswahl der Sonden beginnen, und danach passende Primer aussuchen. Es empfiehlt sich, zwei oder drei Primer je Laufrichtung auszusuchen, und diese in allen Kombinationen experimentell auszuprobieren. Trotz computerunterstützter Auswahl ist die Amplifikationseffizienz und ihre Tendenz Dimere zu bilden überraschend unterschiedlich.

Strukturelle Betrachtungen zum Sondendesign

Strukturelle Besonderheiten beeinflussen das Bindungsverhalten von Nukleinsäuren. Gewöhnlich empfehlen wir 'ausgewogene' Sequenzen zu verwenden, das heißt solche mit einer ungefähren Gleichverteilung der vier Basen. Ungewöhnlich fest bindende Sequenzabschnitte innerhalb einer Sonde vermeidet man. Es sind für gewöhnlich GC-reiche Sequenzen, machen einen ganz kurzen Abschnitt für die Bindung verantwortlich, und somit wird es statistisch auch mehr verwandte falsche Bindungsorte für diese Sequenz geben. Repetitive und monotone Sequenzen geben keinen definierten Bindungsort und führen zu einer Verteilung der Sonde über verschiedene Positionen.

Beispiel: HSV-Typisierung, Espy et al. Clin. Chem (2000)

Es werden Sonden mit 5 aufeinander folgender G in einer Reihe verwendet, die zu einer unsauberen Hybridisierung führen.

Komplementäre Sequenzen, zum Beispiel ausgedehnte Palindrome können zur Dimerisierung einer Sonde führen, was wiederum Auswirkungen auf ihre Verfügbarkeit zur Bindung hat. Sind beide Sonden zueinander komplementär, können sie aneinander binden und erzeugen ein Signal, das unabhängig von der Zielsequenz ist. Noch bedeutsamer sind komplementäre Sequenzen, die zur Hybridisierung innerhalb einer Sonde, sogenannten Stem-Loops führen. Zur Ausbildung dieser Strukturen genügen relativ kurze Sequenzen – die Bindungswahrscheinlichkeit ist erhöht, da die komplementären Bereiche sich nicht voneinander entfernen können und es resultieren daher recht hohe Schmelztemperaturen. Alle Vorgänge, die zu falschen Bindungsereignissen führen, vermindern die Verfügbarkeit der Sonden und damit den Belegungsgrad an der gewünschten Stelle. Die Konsequenz ist ein geringeres Fluoreszenzsignal. Man kann diese Effekte notfalls durch eine erhöhte Sondenkonzentration kompensieren.

Eine sehr wichtige Regel ist es, Komplementaritäten zwischen dem 3'-Ende des Primers und dem anderen Primer der Sonden zu vermeiden. Schon relativ kurze Sequenzabschnitte führen insbesondere zu Beginn der PCR, wenn noch kein Fragment amplifiziert ist dazu, daß Primer-Sonden Dimere gebildet werden, die zu unspezifischen Produkten führen, und eventuell sogar falsche Fluoreszenzsignale erzeugen können.

Generelle Regeln

Die Hybridisierungssonden für den LightCycler® binden benachbart, so daß sich die terminalen Fluorophore gegenüberstehen. Eine FRET Energieübertragung findet nur statt, wenn beide Sonden gebunden sind.

Man verwendet benachbarte Sequenzen auf demselben Strang, mit einer Lücke von 1-5 Basen.

Der FRET ist entfernungsabhängig. Donor und Akzeptor müssen dicht benachbart sein. (deutlich unter 50 Å, dementsprechend unter 15 Basen)

Die 3'-Enden müssen blockiert sein, üblicherweise als 3'-Phosphat und als 3'-Fluorescein.

Die Sonden sollen nicht als Primer arbeiten können.

Die aneinanderliegenden Enden der Sonden sind markiert, und zwar vorzugsweise 3'- mit Fluorescein und 5'- mit dem LightCycler® Red 640/705.

In umgekehrter Orientierung (5'-FAM / 3'-LC) kann der FRET Energietransfer versagen. Die 3'-Markierung mit LightCycler® Red ist nur bedingt möglich. Für Fluorescein muß ein FITC-Derivat verwendet werden, damit die Farbkompensierung akkurat arbeitet.

Die Sonden sollten 'ausgewogen' sein.

siehe folgende Punkte

Monotone Sequenzen sollten vermieden werden.

Die Sonden können in verschiedenen Positionen binden.

Repetitive Sequenzen sollten vermieden werden.

Die Sonden können in verschiedenen Positionen binden.

Extrem GC-reiche Sequenzen sollten vermieden werden.

Es reichen kürzere Sequenzen für eine falsche Bindung.

Extrem Purin-reiche (A,G), insbesondere G-reiche Sequenzen sollten vermieden werden.

Sonden binden schlecht.

Lange Palindrome und insbesondere Stem-Loop Sequenzen sollten vermieden werden.

Längere (>6) GC-reiche Palindrome führen zur Dimerisierung der Sonden. Stemloops führen zur Faltung. Beides vermindert die Menge der frei verfügbaren Sonde in Lösung und kann nur bedingt durch eine Erhöhung der Menge aufgefangen werden.

Die Sonden sollten nicht komplementär sein.

Dimere zwischen den Sonden führen zu einem Signal, das unabhängig von einem Target ist.

Die 3'-Enden der Primer sollten nicht komplementär zu den Sondensequenzen sein.

Am Anfang der PCR ist kaum Target, aber sehr viel Sonde vorhanden, so daß die Primer auf der Sonde binden können und verlängert werden (Dimere).

Die Sonden dürfen nicht zu hoch-schmelzend (Tm < 80°C) sein, damit sie die PCR nicht inhibieren.

Sehr fest bindende Sonden können von der Polymerase bei 72°C nicht weggeschoben werden und verhindern die Extension.