Formate

Fluoreszenz

Der Fluoreszenz-basierte Nachweis ist in den Biowissenschaften inzwischen weit verbreitet. Er hat in vielen Feldern die radioaktive Markierung abgelöst. Fluoreszenzfarbstoffe haben einen 'Umwelt-Vorteil'; sie sind länger haltbar, im Umgang weitgehend unbedenklich und nicht zuletzt auch kostengünstig zu entsorgen.

Zur Markierung von Antikörpern und zur immunologischen Detektion, in der Fluoreszenzmikroskopie oder in der Durchflußzytometrie (FACS) schon lange etabliert, kam die Fluoreszenzdetektion zum Anfang der neunziger Jahre vor allem mit der Einführung neuer DNA-Sequenzierungstechniken in das molekularbiologische Labor. Seit der Verfügbarkeit entsprechender Geräte, insbesondere dem SDS 7700 System von Perkin Elmer und den LightCycler® Geräten von Roche Diagnostics haben Fluoreszenz-basierte 'Real-Time' Systeme ganz neue Möglichkeiten für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) eröffnet.

Die Fluoreszenzdetektion ist keineswegs sensitiver als die immunologische oder gar die radioaktive Markierung, sondern sie wird in den meisten Fällen sogar zehn- bis tausendfach unempfindlicher als eine radioaktive Markierung sein.

Der Vorteil der Fluoreszenz

Der Vorteil der Fluoreszenz besteht zum einen in der Möglichkeit der parallelen Messung unter gleichzeitiger Verwendung verschieden(farbig)er Fluorophore. Zum anderen kann eine d zeitauflösende, kontinuierliche Messung vorgenommen werden. Fluoreszenz läßt sich dabei auch in einem geschlossenen Gefäß beobachten (Closed Tube Format). Mit geeigneten Sonden erlaubt die Fluoreszenzdetektion außerdem eine Genotypisierung von Proben schon während der PCR. So ist die absolute Sensitivität keineswegs der ausschlaggebende Faktor für diese Detektionsmethoden, zumal meist mit Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden gearbeitet wird, insbesondere mit der PCR.

Parallele Messung

Fluoreszenz bezeichnet die Eigenschaft einiger Chromophore, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges, das heißt rotverschobenes Fluoreszenzlicht abzugeben. Die Effektivität dieses Vorganges wird mit der Quantenausbeute Q, einer Zahl zwischen 0 und 1, bezeichnet. Wir kennen dieses Phänomen für Fluoreszenzfarbstoffe in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich, oder in Wellenlängen ausgedrückt, von etwa 300 bis 800 nm. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes-Shift).

Ein gutes Fluorophor ist demnach durch eine starke Absorption (einen hohen Extinktionskoeffizienten), eine hohe Quantenausbeute (Q > 0,7) und einem großen Stokes-Shift gekennzeichnet. Gleichzeitig muß die verwendete Lichtquelle auf den Farbstoff abgestimmt sein. Sie sollte in der Nähe des Absorptionsmaximums einstrahlen. Da das abgegebene Licht eine gewisse Bandbreite hat, müssen verschiedenfarbige Fluorophore einen Abstand von 15-50 nm voneinander haben, damit sie gleichzeitig nebeneinander detektiert werden können. Da das Absorptionsmaximum parallel verschoben wird, dürfen die Farbstoffe bei der Verwendung einer monochromatischen Lichtquelle, z.B. eines Lasers, nicht zu weit auseinander liegen. Das bedeutet für die Praxis, daß abhängig von dem zur Verfügung stehenden Instrument zwei bis vier Farbstoffe gleichzeitig beobachtet werden können. Zukünftig könnten auch die unterschiedlichen Lebensdauern der Fluoreszenz verschiedener Farbstoffe etwa gleicher Wellenlänge dafür verwendet werden, um mehrere Proben gleichzeitig auswerten zu können.

Zeitauflösung

Fluorophore sind auf ihre Umgebung sensibilisiert. Sie können durch benachbarte Moleküle, besonders durch andere Chromophore 'gequencht' werden. Das bedeutet, sie werden in ihrer Fluoreszenz gemindert oder gar gelöscht. Umgekehrt können benachbarte Fluorophore ihre Energie aufeinander übertragen, ein Phänomen, das als Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bezeichnet wird. Mittels dieser Eigenschaften lassen sich molekulare Sensoren entwickeln, die Auskunft über die Anwesenheit oder die Konfiguration von Molekülen geben. FRET ermöglicht plötzlich die kontinuierliche Beobachtung einer Reaktion, ohne daß Bindungspartner weggewaschen oder getrennt werden müßten, wie das bei allen herkömmlichen Assays der Fall ist, die auf Bindungen beruhen. Beispiele für 'herkömmliche' Methoden sind der Nothern- und der Southern-Blot, reverse Blot-Techniken, die Bindung von PCR-Produkten in Mikrotiterplatten oder auf Membranen, cDNA Arrays oder DNA-Chips und ihre Detektion mittels radioaktiv markierter Marker oder Haptenen und Enzym-konjugierter Antikörper, beispielsweise dem Digoxigenin-System.

Quantitative PCR (qPCR)

Die kontinuierliche Verfolgung der Nukleinsäure-Amplifikation eröffnet ganz neue Möglichkeiten in der Quantifizierung von Nukleinsäuren. Die Menge an Target-Nukleinsäuren sind für unterschiedliche Fragstellungen von Relevanz: In der Virologie wird der Titer von Viren bestimmt, zum Beispiel um den Erfolg einer antiviralen Therapie verfolgen zu können. Im Falle leukämischer Erkrankungen wird sowohl der Therapieerfolg dokumentiert als auch ein Rezidiv frühzeitig erkannt (Minimal Residual Disease, MRD). Nach Knochenmarkspenden kann die Vermehrung der Spenderzellen dokumentiert werden. Und in Lebensmitteln können die Inhaltsstoffe quantifiziert werden, zum Beispiel der Gehalt an genmodifizierten Bestandteilen.

Bisher beschränkte man sich bei der quantitativen PCR-Analyse entweder auf die bloße Abschätzung der Amplifikat-Mengen aus der Gelelektrophorese oder es wurden mehrere Ansätze in Gegenwart einer konkurrierenden Kompetitor-Amplifikation durchgeführt, um das Target gegen die bekannte Kompetitormenge auszutitrieren. Die mittels Fluoreszenzmessung mögliche kontinuierliche Bestimmung der Amplifikatmenge erlaubt eine viel einfachere Bestimmung der Templatmenge. Die Anzahl von PCR-Zyklen zur Erreichung einer bestimmten Produktmenge verhält sich über weite Bereiche proportional zur Menge an Ausgangsmaterial. Es wird regelmäßig von linearen Bereichen von mindestens vier bis sieben Zehnerpotenzen berichtet. Die Daten fallen schon während der PCR an; die Ergebnisse liegen spätestens am Ende der Reaktion vor, ohne weitere Pipettierschritte, ohne ein Kontaminationsrisiko durch Amplifkationsprodukte und ohne eine Gelelektrophorese.

Real-Time PCR-Formate

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um reaktionsabhängig fluoreszente Signale zu erzeugen. Am einfachsten ist die Verwendung eines Farbstoffes, der an doppelsträngige DNA bindet und dann fluoresziiert (Ethidiumbromid, SYBR Green§). Allerdings ist das Signal nicht wirklich spezifisch. Diese Farbstoffe detektieren auch Primer-Dimere und falsche Amplifikate.

Es gibt verschiedene Typen von Sonden, die unter Ausnutzung von FRET oder Quenching abhängig vom Vorliegen ihres Komplementes ein Fluoreszenzsignal erzeugen.

TaqMan® Sonden, Hydrolyseproben, 5'-Nuklease Verfahren

TaqMan

TaqMan® Sonden sind einzelsträngige Oligonukleotide, die inmitten eines Amplicons binden können und mit einem Fluorophor und einem Quencher in einem Abstand von 3 bis etwa 30 Basen versehen sind. Im Zuge der Amplifikation wird diese Sonde durch eine mit der Taq Polymerase assoziierte doppelstrangspezifische Nukleaseaktivität hydrolysiert. Auf diese Weiseb wird die Minderung der Fluoreszenz durch die räumliche Trennung vom Quencher aufgehoben - das Fluoreszenzsignal steigt.

Die TaqMan® Sonden sind relativ sensibel auf einzelne Fehlbasen. Das ist bei der Analyse von beispielsweise virologischen Proben von Bedeutung. Bei derartigen Untersuchungen ist eine solche genetische Varianz zu erwarten, daß das Signal trotz erfolgreicher Amplifikation fehlen kann. Diese Sensitivität läßt sich leider nicht ohne weiteres zur Genotypisierung verwenden, da ein 'Nichtsignal' einem Genotypus zugeordnet werden müßte.

Benachbarte Hybridisierung

Adjacent Hybridization

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, zwei Oligonukleotide nebeneinander oder gegenüber hybridisieren zu lassen. (i) Die erfolgreichste Methode ist wahrscheinlich die benachbarte Bindung zweier einfach markierter Sonden auf einem Templat, dem HybProbe Format für die LightCycler® Geräte. Die Messung erfolgt hier über die Fluoreszenz des Akzeptorfarbstoffes, der über den FRET Prozeß angeregt wird.

Der Vorteil gegenüber den Hydrolyseproben ist sicherlich ihr modularer Aufbau und für die quantitative PCR ihre relative Unempfindlichkeit gegenüber einzelnen Fehlpaarungen. Vor allem aber eigenen sie sich für die Genotypisierung.

Ihr Nachteil ist eventuell der längere Bereich an Sequenz, der hier durch zwei benachbarte Sonden abgedeckt werden muß.

Adjacent Hybridization

Statt zweier hybridisierender Sonden kann auch der eine Primer markiert sein, und mittels einer auf dem anderen Strang liegenden benachbarten Probe detektiert werden.

In der gleichen Weise ist über die Verdrängung einer, dem Primer komplementären, Sonde die Amplifikation verfolgt worden. Allerdings kann hier wiederum eine unspezifische Reaktion nicht ausgeschlossen werden.

Adjacent Hybridization

Weiterhin sind selbstkomplementäre Oligonukleotidpaare - ausgestattet mit einem Fluorophor und einem Quencher - zum Monitoring der PCR verwendet worden. Diese binden im Gleichgewicht auch an das PCR-Produkt und geben dann ein Fluoreszenzsignal.

Molecular Beacons

Molecular Beacons

Eine interessante Spielart der Hybridisierungssonden sind die Molecular Beacons (entwickelt von Fred R. Kramer). Sie tragen an ihren Enden selbstkomplementäre Enden und ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Stem-Loop Struktur vorliegen und erst mit einem entsprechenden Target ein Fluoreszenzsignal liefern. Molecular Beacons sind wiederum sehr sensibel für Fehlpaarungen.

Sunrise

Die Sunrise-Primer entsprechen den Molecular Beacons. Sie sind selbstkomplementär und entfalten sich durch die Synthese des Gegenstranges. Naturgemäß geben auch sie Fluoreszenzsignale aufgrund von unspezifischen Produkten und Primer-Dimeren ab.

Genotypisierung

Die Untersuchung von Polymorphismen ist für die Genotypisierung von Interesse. Beispiele sind die Vaterschaftsbestimmung, die Bestimmung von Spezies, das Vorliegen von genetischen Risikofaktoren und Erkrankungen auslösenden Allelen. Das Vorliegen von Polymorphismen kann bei TaqMan® Probes und Molecular Beacons nur mit jeweils unterschiedlichen Sonden geschehen, die alle Varianten erfassen. Mit verschiedenen Fluorophoren ausgestattet, können diese auch im gleichen Reaktionsansatz verwendet werden. Demgegenüber haben die HybProbe Sonden den ausgesprochenen Vorteil, daß das Vorliegen einer Mutation mit Hilfe nur einer spezifischen Sonde mittels einer Schmelzkurve über die Verminderung der Schmelztemperatur bestimmt werden kann. Im homozygoten Fall erhält man einen einheitlich hohen oder niedrigen Temperaturübergang, und für heterozygote Proben zwei Temperaturübergänge.

Ausblick:

Die neuen Real-Time PCR Verfahren erlauben eine sehr viel schnellere Analyse von Proben. Sie ermöglichen den qualitativen Nachweis einer Nukleinsäure, ihre Quantifizierung und ihre Genotypisierung. Der Zeitbedarf für die Durchführung schrumpft mit den kapillarbasierten LightCycler® Geräten bis auf 20 bis 30 Minuten, so daß diese Verfahren heute auch für die Notfallanalyse in Frage kommen. Durch den Wegfall vieler Arbeitsschritte sind viele Analysen zudem kostengünstiger durchführbar, was die Verwendung der PCR Methode in der Diagnostik weiter vorantreiben dürfte.

Hapten modifizierte Sonden

Hapten modified Probes

Werden häufig bei der spezifischen Detektion durch Hybridisierung an membrangebundener Nukleinsäuren, in vitro und in situ verwendet. Die Detektionsmethode basiert auf der Wechselwirkung von Molekülen mit einer hohen Bindungsaffinität an haptene z. B. Streptavidin, Antikörper die wiederum an Enzymen konjugiert sind (Peroxidasen, Phosphatasen). In einem abschließendem Inkubationsschritt wird das hinzugegebene Enzymsubstrat in ein messbares/detektierbares Produkt umgewandelt.

In vielen Fällen bietet diese Methode einen guten Ersatz für Isotop markierte Sonden dar.

Fluoreszenz-markierte Sonden.

TIB MOLBIOL bietet eine breite Palette an Fluoreszenzfarbstoffen an, die das Spektrum von nahe UV bis Infrarot abdeckt. Die Anwendung Fluoreszenz-markierter Sonden reicht von der automatischen Sequenzierung, über Mikrosatelliten-Analysen, bis hinzu in situ Hybridisierungen. Im Preis inbegriffen ist die Sequenz bis zu maximal 30 Basen, alle Modifikationen und HPLC- oder FPLC-Reinigungen. Die Produkte werden entsalzt, lyophilisiert und mit einem detaillierten Produktbeschreibungsdatenblatt verschickt.

Disclaimer:
TaqMan® und LightCycler® sind eingetragene Warenzeichen von Roche, SYBR Green ist ein Warenzeichen von Molecular Probes. PCR und das 5'-Nuklease-Verfahren sind von Hoffmann La-Roche patentiert. Molecular Beacon Sonden sind von PHRI patentiert. Das Sunrise Prinzip ist von Onkor patentiert. TIB MOLBIOL besitzt Lizenzrechte zur Herstellung von Hybridisierungssonden für die LightCycler® Instrumente und für die Herstellung von Molecular Beacon Sonde sowie für die Markierung von Sonden mit verschiedenen Fluorophoren.